HPLC – Welcher Detektor kommt zum Einsatz?

Der in der High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) am häufigsten eingesetzte Detektor ist unstrittig der UV/VIS-Detektor.Wir als Auftragslabor verfügen an allen HPLC-Geräten über diesen Detektor, an einige Geräte ist ein zweiter Detektor gekoppelt. Im Folgenden eine Übersicht über die unterschiedlichen Detektoren und ihre Bestimmungen:

UV/VIS-Detektor

Da die meisten Arzneimittelwirkstoffe Licht im UV-Bereich absorbieren, können sie mit dem Standarddetektor in der HPLC, dem UV/VIS-Detektor, analysiert werden. Der UV/VIS-Detektor ist vergleichbar mit einem Photometer aufgebaut; daher findet hier auch das Bouguer-Lambert-Beer’sche Gesetz Anwendung. Beim UV/VIS-Detektor wird Licht einer bestimmten Wellenlänge ausgestrahlt. Anschließend wird gemessen, wie viel Licht am Ende der Durchflussmesszelle, die von der mobilen Phase mit ihren Analyten durchflossen wird, noch vorhanden ist. Die Differenz der Lichtmenge ist von der zu analysierenden Substanz absorbiert worden. Somit können alle Substanzen bestimmt werden, die UV- oder sichtbares Licht absorbieren oder über Derivatisierung in solche Verbindungen überführt werden können. Zum Einsatz kommen variable Wellenlängendetektoren (VWD) und Diodenarray-Detektoren (DAD). Während Diodenarray-Detektoren mehrere Wellenlängen parallel aufnehmen oder ganze Spektren von Substanzen aufzeichnen können – für jede Wellenlänge steht eine eigene Photodiode zur Verfügung – ist der Arbeitsbereich der VWDs etwas größer. Hier kann gleichzeitig nur eine Wellenlänge detektiert werden, wodurch das Rauschen etwa um die Hälfte kleiner ist und somit die Empfindlichkeit des Detektors um das Doppelte steigt.

Fluoreszenz-Detektor

Wie der UV/VIS-Detektor gehört der Fluoreszenz-Detektor auch zu den spektroskopischen Detektoren; er ist jedoch selektiver und empfindlicher einsetzbar. Beim Fluoreszenz-Detektor wird Licht einer bestimmten Wellenlänge ausgestrahlt und durch eine Durchflusszelle geleitet. Diese enthält die mobile Phase mit dem Analyten, der das ausgestrahlte Licht absorbiert und bei einer anderen, längeren Wellenlänge wieder abstrahlt. Dieses emittierte Licht wird im 90-Grad-Winkel abgeleitet und gemessen. Während beim UV/VIS-Detektor das Licht in einer „Linie“ gemessen wird, ist beim Fluoreszenz-Detektor die senkrechte Umleitung erforderlich, um nur die Emissionsstrahlung und nicht auch die Anregungsstrahlung als Störung mitzubestimmen. Bestimmt werden können mit diesem Detektor nur Substanzen, die selbst fluoreszieren oder zu fluoreszierenden Verbindungen umgesetzt werden. Daher ist der Fluoreszenz-Detektor nicht universell einsetzbar, zeigt bei Verwendung aber eine hohe Selektivität.

Brechungsindex-Detektor (RI-Detektor –refractive index detector)

Der Brechungsindex-Detektor ist vom Funktionsprinzip ein universeller Detektor, der die Änderung der Lichtbrechung der Probelösung im Vergleich zur mobilen Phase misst. Im Vergleich zu den anderen beschriebenen Detektoren kann hier nur mit einem isokratischen Trennsystem gearbeitet werden, da die mobile Phase als Referenz dient. Ein Gradientensystem kommt somit nicht zum Einsatz. Mit Hilfe eines Spiegelsystems fällt der Lichtstrahl während der Messung zuerst durch die Referenzmesszelle mit der mobilen Phase und anschließend durch die Probenmesszelle mit dem Analyten. Das Licht wird durch Dioden aufgefangen. Fließt durch die Probenmesszelle ebenfalls reine mobile Phase, ändert sich die Lichtbrechung nicht und die maximale Lichtmenge kommt bei den Dioden an. Anders sieht es aus, wenn eine Substanz mit anderem Brechungsindex die Probenmesszelle durchfließt, wodurch das Licht abgelenkt wird und nur eine reduzierte Lichtmenge bei den Dioden ankommt. Der Brechungsindex ist sehr temperaturabhängig. Während der Detektion muss die Temperatur konstant gehalten bzw. die Messzelle des Detektors temperiert werden. Da die Differenz des Brechungsindex von Substanzen eher gering ist, sind die Selektivität oder die Empfindlichkeit des Detektors entsprechend wenig ausgeprägt. Der Brechungsindex-Detektor findet u. a. bei der Bestimmung von Zuckern Verwendung, die nicht UV-aktiv sind und daher mit dem UV/VIS-Detektor nicht nachweisbar sind.

Massenspektrometrie-Detektor (MS-Detektor)

Während sich das Funktionsprinzip bei den bisher beschriebenen Detektoren leicht skizzieren lässt, gilt es bei massenspektrometrischen Detektoren verschiedene Ausführungen zu beachten. Allgemein lässt sich sagen, dass die Massenspektrometrie darauf beruht, dass der zu untersuchende Analyt in die Gasphase überführt und anschließend ionisiert wird. Die Ionen bzw. Fragmente werden entsprechend des Verhältnisses Masse/Ladung detektiert. Je nach Einstellung kann man mit einem MS-Detektor im Zuge einer Einzeluntersuchung entweder selektiv nach einer oder mehreren Einzelsubstanzen suchen oder ein Massenspektrum der in der Probe vorhandenen Substanzen aufnehmen. Dabei können auch mehrere gleichzeitig eluierende Substanzen differenziert und bestimmt werden. MS-Detektoren unterscheiden sich zu einem in der Art der Ionisierungsquelle, dem massenspektrometrischen Analysator und dem eigentlichen Detektor. Dabei werden verschiedene Kombinationen von Ionisierungsquellen, Analysatoren und Detektoren mit erheblichen Unterschieden hinsichtlich Empfindlichkeit, Genauigkeit und apparativem Aufwand eingesetzt. In unserem Labor kommt als Ionisierungsquelle die Elektrospray-Ionisation (ESI) zusammen mit einem Single-Quad(ropol)-Detektor zum Einsatz. Als mobile Phase können nur flüchtige Lösemittel und Salze verwendet werden, da der Analyt zusammen mit der mobilen Phase verdampft werden muss. An einer Metallkapillare wird Hochspannung angelegt, wodurch die Analyt-Moleküle ionisiert werden. Je nach Ladung der Spannung können positiv oder negativ geladene Ionen entstehen. Gleichzeitig wird mit Hilfe von Stickstoff das Lösemittel verdampft (elektrostatische Zerstäubung). Auf Detektorseite wird durch Anlegen von Spannung der entgegengesetzte Pol erzeugt. Die Ionen werden dadurch beschleunigt und gelangen so zum Analysator-Eingang. Ein Quadropol-Analysator besteht aus vier quadratisch angeordneten Stäben, an denen hochfrequente Spannung angelegt wird. Die auf eine bestimmte Masse eingestellte Spannung bewirkt, dass die Ionen in Richtung Detektor fokussiert und nur die Ionen mit der gesuchten Masse herausgefiltert werden und zum Detektor gelangen. Am Detektor wird das Signal erfasst und nochmals verstärkt. Der MS-Detektor arbeitet im Hochvakuum. Neben dem beschriebenen Quadropol-Massenanalysator gibt es noch empfindlichere und hochauflösendere Techniken, die zur Strukturaufklärung chemischer Verbindungen eingesetzt werden können. Die dabei entstehenden MS-Chromatogramme sind hinsichtlich der Auswertung und Aussagekraft komplexer als die typischen UV/VIS-Chromatogramme.