Validierung chromatographischer Methoden

Die in der pharmazeutischen Analytik erhaltenen Ergebnisse bilden die Grundlage für Entscheidungen, die oft weitreichende Folgen für die Patientensicherheit haben. Voraussetzung für eine optimale Patienten- und Arzneimittelsicherheit ist dabei die Anwendung validierter Prüfmethoden.

Ziel der analytischen Methodenvalidierung ist der Nachweis der Eignung eines Prüfverfahrens für die beabsichtigte Verwendung. Die bei Untersuchungen zur Anwendung kommenden Analysenverfahren müssen validiert werden, um sicherzustellen, dass die ermittelten Ergebnisse korrekt und präzise sind. Die Validierung ist dabei in dem Umfang durchzuführen, der zur Erfüllung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung und der Vorgaben der ICH-Richtlinie Q2 (R1) notwendig ist. Der Bereich und die Genauigkeit der mit diesen Verfahren erreichbaren Werte (z. B. Nachweisgrenze) müssen diesen Anforderungen entsprechen.

Die Validierung besteht aus drei Schritten:

1. Erstellen eines Validierungsplans

Der Validierungsplan sollte folgende Punkte beinhalten

• Auflistung und Beschreibung der zu validierenden analytischen Kenngrößen mit Angaben über die Anzahl der Aufarbeitungen und deren Konzentrationsniveaus
• Beschreibung des einzusetzenden Proben- und Placebomaterials und Festlegung der Spezifikationen des Referenzmaterials
• Beschreibung des Verfahrens zur Probenaufarbeitung bzw. Verweis auf Prüfmethode
• Beschreibung der Messmethode bzw. Verweis auf Prüfmethode
• Festlegung der Akzeptanzkriterien
• Änderungshistorie

2. Durchführung der Validierung

Im Vorfeld einer Validierung kann es ratsam sein, eine sogenannte Präanalytik durchzuführen. So können mögliche Probleme frühzeitig erkannt und behoben werden. Ein Beispiel dafür ist die Ermittlung der Bestimmungsgrenze, da diese stets abhängig von dem verwendeten Gerät ist. Die Einhaltung bestimmter Vorgaben kann dabei die Verwendung der analytischen Geräte einschränken.

3. Erstellen des Validierungsberichts

Die Dokumentation erfolgt je nach Anforderung in Form eines Validierungsberichtes. Gibt es keine Kundenvorgaben, so sollte der Validierungsbericht die nachfolgenden Punkte beinhalten:

• Verweis auf Validierungsplan über Validierungsnummer
• Aufgabenstellung
• Prüfgegenstand
• Prüfverfahren bzw. Verweis auf Prüfverfahren
• ggf. erfolgte Abweichungen zum Validierungsplan und daraus resultierende Maßnahmen
• Datum oder Zeitintervall der Untersuchungen
• Eingesetzte Geräte, Referenzmaterialien und Chemikalien
• Beschreibung der durchgeführten Arbeiten (z. B. Einwaagen, Herstellen von Lösungen usw.)
• Geräteparameter, bei beispielsweise chromatographischen Verfahren: chromatographische Bedingungen
• Ergebnisse der Validierung
• Bei chromatographischen Methoden: Beispielchromatogramme
• Eine Zusammenfassung und Bewertung der Daten hinsichtlich der Übereinstimmung mit den Akzeptanzkriterien inkl. der Aussage, ob das analytische Verfahren valide ist
• Genehmigung durch die verantwortliche Person
• Historie

Validierungselemente

Je nach Zielsetzung sind folgende Kenngrößen zu validieren:

• Spezifität/Selektivität
• Richtigkeit und Wiederfindungsrate
• Präzision
• Linearität
• Arbeitsbereich
• Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze
• Robustheit (inkl. Proben- und Standardstabilität)

Bei der Durchführung von Validierungen werden verschiedene Gruppen von Methoden unterschieden. Daraus resultiert die Auswahl der oben beschriebenen Kenngrößen, die für die Validierung angewendet werden. Häufige zu validierende Gruppen von Methoden sind im Folgenden aufgelistet:

• Identitätstests
• Prüfung auf Wirkstofffreisetzung (Dissolution)
• Gehaltsbestimmungen: u. a. von Wirkstoffen oder anderen definierten Bestandteilen, z. B. Konservierungsmittel Quantitative Bestimmungen von Verunreinigungen und Grenzwertbestimmungen von Verunreinigungen

Begrifflichkeiten

1. Selektivität / Spezifität

Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene, nebeneinander zu bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Störung zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren. Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, eine Substanz oder eine Substanzklasse ohne Verfälschung durch andere in der Probe vorhandene Komponenten zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren.

2. Präzision

• Messpräzision / Gerätepräzision: abhängig vom verwendeten Gerät, Maß für Schwankungen des Geräts.
• Methodenpräzision: Dabei handelt es sich um die zufällige Streuung der Analysenergebnisse.
• Wiederholpräzision: ein Labor, ein Gerät, ein Analytiker
• Laborpräzision: ein Labor, mehrere Geräte, mehrere Analytiker, unterschiedliche Tage
• Vergleichspräzision: mehrere Labore, mehrere Geräte, mehrere Analytiker

3. Linearität

Für quantitative Auswertungen ist die Verwendung geeigneter Kalibrier- und Analysenfunktionen Voraussetzung. Eine Methode ist in einem bestimmten Konzentrationsbereich linear, wenn das Messsignal direkt proportional zur Analytkonzentration in der Probe ist. Zur Überprüfung der Linearität werden üblicherweise fünf äquidistante Konzentrationsniveaus über den Arbeitsbereich überprüft (Aufdotieren von Placebo mit Wirkstoff).

4. Arbeitsbereich

Im Zusammenhang mit der Linearität wird oft der „Arbeitsbereich“ genannt. Dies ist der Bereich zwischen der niedrigsten und der höchsten Konzentration (Menge) des Analyten in der Probe, für den die geforderte Präzision und Genauigkeit bewiesen wurde.

5. Richtigkeit

Die Richtigkeit ist das Maß für die Abweichung vom richtigen Wert aufgrund eines systematischen Fehlers. Wird üblicherweise über die Wiederfindungsrate bestimmt.

6. Wiederfindung

Mit der Wiederfindung wird die Probenaufarbeitung (z. B. Extraktion) überprüft. In der Praxis werden Linearität, Richtigkeit und Wiederfindung, wenn es die Probe zulässt, oft in einem Arbeitsschritt geprüft. Eine mögliche Vorgehensweise ist dabei, fünf Konzentrationen über den Arbeitsbereich mit mindestens zwei (besser drei) Aufarbeitungen über den gesamten Arbeitsbereich. Dabei werden die Placebobestandteile mit Wirkstoff dotiert.

7. Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Nachweis- und Bestimmungsgrenze sind üblicherweise bei Reinheitsbestimmungen durchzuführen. Die Nachweisgrenze ist die geringste Menge einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, die qualitativ noch erfasst werden kann. Im Gegensatz dazu ist die Bestimmungsgrenze die geringste Menge einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, die mit gegebener Präzision und Richtigkeit quantitativ bestimmt werden kann.

8. Robustheit

Als Robustheit wird die relative Unempfindlichkeit eines Analyseverfahrens gegenüber Änderungen der analytischen Rahmenbedingungen bezeichnet. Unterschieden werden dabei zum einen die Änderung der Probenaufarbeitung (z. B. Dauer der Extraktion, oder Verwendung unterschiedlicher Filter) und zum anderen die Änderung der gerätespezifischen Bedingungen (z. B. bei HPLC-Methoden:Temperatur des Säulenofens, Änderung des pH-Werts der mobilen Phase). In der Regel werden dabei mindestens die Standardlösung, eine Probelösung sowie eine Selektivitätslösung (enthält 100 % Placebo, 100% Wirkstoff sowie alle potentiellen Verunreinigungen am Grenzwert) überprüft.